说明常用蛋白质测定方法的原理,并对各种方法加以比较
说明常用蛋白质测定方法的原理,并对各种方法加以比较?1、凯氏定氮法准备4个50mL凯氏烧瓶并标号,想1、2号烧瓶中加入定量的蛋白质样品,另外两个烧瓶作为对照,在每个烧瓶中加入硫酸钾-硫酸铜混合物,再加入浓硫酸,将4个烧瓶放到消化架上进行消化
1、凯氏定氮法
准备4个50mL凯氏烧瓶并标号,想1、2号烧瓶中加入定量的蛋白质样品,另外两个烧瓶作为对照,在每个烧瓶中加入硫酸钾-硫酸铜混合物,再加入浓硫酸,将4个烧瓶放到消化架上进行消化。
消化完毕后进行蒸馏,全部蒸馏完毕后用标准盐酸滴定各烧瓶中收集的氨量,直至指示剂混合液由绿色变回淡紫红色,即为滴定终点,结算出蛋白质含量。
2、双缩脲法
双缩脲法是第一个用比色法测定蛋白质浓度的方法,硫铵不干扰显色, Cu2+与蛋白质的肽键,以及酪氨酸残基络合,形成紫蓝色络合物,此物在540nm波长处有最大吸收。
利用标准蛋白溶液和双缩脲试剂绘制标准曲线,将待测血清与硫酸钠在待测试管中混合,并只加入硫酸钠不含血清的试管作对照,将两支试管加入等量的双缩脲试剂,混合后于37℃环境中放置10分钟,在540nm波长进行比色,以对照管调零,读取吸光度值,标准曲线上直接查出蛋白质含量。
3、酚试剂法
取6支试管标号,前5支试管分别加入不同浓度的标准蛋白溶液,最后一支试管加待测蛋白质溶液,不加标准蛋白溶液,每支试管液体总量加入蒸馏水补足而保持一致,混合均匀,在室温下放置30分钟,以未加蛋白质溶液的第一支试管作为空白对照,于650nm波长处测定各管中溶液的吸光度值。
4、紫外吸收法
大多数蛋白质在280nm波长处有特征的最大吸收,这是由于蛋白质中有酪氨酸,色氨酸和苯丙氨酸存在,可用于测定0.1~0.5mg/mL含量的蛋白质溶液。
取9支试管分别标号,前8支试管分别加入不同浓度的标准蛋白溶液,1号试管不加标准蛋白溶液,最后一支试管加待测蛋白质溶液,而不加标准蛋白溶液,每支试管液体总量通过加入蒸馏水补足而保持一致,将液体混合均匀,在280nm波长处进行比色,记录吸光度值。
5、考马斯亮蓝法
Bradford浓染液的配制:将100mg考马斯亮蓝G-250溶于50ml 95%乙醇,加入100ml85%的磷酸,用蒸馏水补充至200ml,此染液放4℃至少6个月保持稳定。
标准曲线蛋白质样本的准备:尽量使用与待测样本性质相近的蛋白质作为标准品,测定抗体,可用纯化的抗体作为标准。待测样本是未知的,也可用抗体作为标准蛋白。通常在20ug—150ug/100ul之间绘制标准曲线。
将待测样本溶于缓冲溶液中,该缓冲溶液应与制作标准曲线的缓冲溶液相同(最好用PBS)。按1:4用蒸馏水稀释浓染料结合溶液,出现沉淀,过滤除去。
每个样本加5ml稀释的染料结合溶液,作用5~30min。染液与蛋白质结合后,将由红色变为蓝色,在595nm波长下测定其吸光度。注意,显色反应不得超过30min。根据标准曲线计算待测样本的浓度。
参考资料来源:百度百科-蛋白质测定
参考资料来源:百度百科-考马斯亮蓝法
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