论文肝炎病毒研究及其疫苗应用进展、肽疫苗研究及其疫苗应用进展..帮忙推荐些资料!
来源：碳中和网
时间：2021-04-12 07:00:56
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论文肝炎病毒研究及其疫苗应用进展、肽疫苗研究及其疫苗应用进展..帮忙推荐些资料!?
近年来有关HCV感染的研究进展很快，但主要体现在实验诊断技术的发展、抗病毒治疗的应用、发病机理的探讨和病理改变的观察等方面，而有关HCV感染的保护性免疫和疫苗制备的研究进展则很慢。虽然HCV检测技术的改进和提高已大大降低血液制品传播HCV的危险性，但在高危人群中HCV感染仍严重，甚至不少感染者并没有明显的输血史;由于HCV基因序列的高度变异性，导致HCV准种(quasispecies)的存在和免疫逃避现象，从而使HCV得以逃脱宿主免疫机制作用，造成HCV感染慢性化，因此，研究预防/治疗性疫苗，以控制HCV感染有着重要意义。合成肽疫苗由于具有制备容易、可大量生产以及稳定、易保存、副作用少和使用较安全等优点，近几年得到了广泛重视。本文拟将HCV合成肽疫苗的发展作一综述。
预防性疫苗
HCV在生物学分类上与动物的瘟病毒和人类的黄病毒相似。已知黄病毒非结构(NS)蛋白和瘟病毒gp33/gp55可刺激机体产生中和抗体，提示与其基因和疏水图非常相似的HCV包膜蛋白可能是机体免疫攻击的靶。Choo等[1]曾用重组痘苗病毒在HeLa细胞中表达的HCV包膜蛋白E1和E2接种7只黑黑猩猩，证实HCV e蛋白诱生的抗体是中和性抗体，可以预防/阻止病毒持续感染，故能够作为预防性疫苗。Farci等[2]将一慢性HCV感染者不同年代的血浆灭活，并与病毒混合后接种黑猩猩，以研究HCV感染者体内是否有特异性中和抗体。结果发现，用该患者感染HCV14年的血浆与病毒混和物接种的黑猩猩全部被感染，而用该患者感染HCV2年的血浆与病毒混和物接种，黑猩猩未发生HCV感染，因此作者认为在慢性HCV感染者体内有HCV准种和特异性中和抗体。随后该作者[3]以HCVH77高变区1(HVR1)合成的两条肽390~410和384~414氨基酸免疫家兔后得到抗HVR1超免疫血清，然后给5只黑猩猩接种这种血清与不同HCV准种H77/H79混合物，结果显示抗-HVR1对同源H77株有免疫防御作用，对混合的HCV准种则无此作用，因此认为:中和抗体攻击的主要靶位是E2/NS1的HVR1，而且抗-HVR1的中和作用有病毒株特异性。
Weiner[4]F发现E2存在两个HVR，并确定HVR含有诱生中和抗体的表位。Rosa等[5]结合细胞荧光标记与流式细胞计数技术，建立了HCVE2蛋白与靶细胞结合中和定量检测系统，结果提示至少存在两个中和性表位，一个是高度变异的，另一个存在于E2的其他区域。Zibert等[6]以成纤维细胞(VH3)研究体外阻断HCV感染也发现抗-HVR1的中和作用有少部分存在交叉反应，不是所有抗-HVR都是株特异的;他们还观察到HCV感染的早期即出现抗包膜糖蛋白上HVR1的抗体可导致自限性感染，说明抗-HVR1具有保护作用，可以阻断HCV感染的发展[7]。所有这些都提示中和抗体的攻击靶位是E2/NS1的HVR1，以HCV包膜糖蛋白HVR1为基础备预防性疫苗是可行的。
但是中和抗体识别的蛋白表位大多是不连续的，即中和性抗原表位大多是构象的，抗体识别的是构型而非组成它们的序列，这在对口蹄病毒(FMDV)中具有诱生中和抗体的肽段的X射线晶体分子衍射分析及其他一些试验得到证实[8];最近的研究也表明E1E2复合体上构型表位的形成对包膜糖蛋白诱导机体产生保护性免疫方面起着重要作用[9]。这就要求在合成HCV包膜糖蛋白的多肽疫苗时不但注意所选择肽段的免疫原性，而且必须考虑免疫原性蛋白和其他蛋白质及核酸三者间的交互作用所涉及到的构象限制。因此，研究并模拟E蛋白表位的构型和在细胞膜上的暴露状态，是最终制备有效疫苗的基础。
多抗原肽(MAP)是以核心基质为交联体或树状臂，将若干条抗原表位相同或不同的单体肽偶联在一起，形成树枝结构，则不但可克服上述方法的不足，而且能很好模拟天然表位构象，具有明显的优越性，已经用于人类免疫缺陷症病毒(HIV)、FMDV、乙型肝炎病毒(HBV)和疟原虫等多种病原体保护性抗原的分析和分子疫苗的设计。MAP骨架仅含多个赖氨酸，能在确切的部位结合4条或8条多肽链，多肽链的分子量可占整个疫苗的95%;由于MAP上肽链结合的数量及位置确切，制备的疫苗结构均一、纯度高，MAP与多肽的结构物免疫原性强，无需再偶联载体蛋白便能诱生高滴度、高亲和力的抗体，而MAP本身没有免疫原性，故既能提高疫苗的质量又能去除载体蛋白的缺陷。
治疗性疫苗
由于目前也有学者认为HCV感染后不能产生有效的保护性抗体，故细胞免疫在抗HCV感染中的作用越来越受到重视。细胞毒性T细胞(CTL)是执行细胞免疫应答的主要效应细胞，属于CD8+T细胞，当其表面受体(TCR)与靶细胞的HCV抗原结合后，在主要组织相容性复合物(MHC)Ⅰ类抗原的介导下，通过溶解受感染的靶细胞达到清除病毒的目的，但同时亦可造成感染组织的损伤。研究表明，丙型肝炎患者的肝脏病理变化主要表现为汇管区淋巴细胞聚集和淋巴滤泡形成，在肝脏碎屑样坏死区以CD4+细胞浸润为主，而在肝小叶区则以CD8+细胞居多;急慢性HCV感染者外周血和肝脏中特异性CTL可以识别HCV编码蛋白质中的一个或多个表位;人工合成的HCV多肽，可在体外刺激CTL增殖，并增强其溶解HCV感染靶细胞的能力，因此CTL在清除HCV感染中可能起重要作用。
Kita等[10]发现用HCV核心区合成多肽反复刺激病人的外周血单个核细胞(PBMC)后，能诱导CD8+的特异性抗HCV cTL，这种CTL不但识别与HLA-B44+分子相结合的核壳蛋白(NP)81-100合成多肽，而且还能溶解VAC-HCV感染的靶细胞。该作者[11]又用重组HCVNP和合成的重叠肽作抗原对3例慢性丙型肝炎病人的PBMC反复刺激，发现他们均可产生能识别NP81-100序列的特异性、HLA-B44+限制中CTL;在1例病人中观察到能识别NP1-120序列的外周血淋巴细胞，并证明其属CD4+T细胞，主要识别NP21-40表位和81-100表位，而NP1-120和Th表位可在体外增强HCV特异性CTL产生。作者注意到此病人血液HCV阴性，丙氨酸转氨酶(ALT)水平也正常，而另两例存在NP却无CTL活性增强的病人，血液HCV阳性，ALT水平升高。作者认为当持续感染HCV时，尽管CTL参与免疫病理损伤导致严重肝损伤，但可加速感染机体中HCV的清除;Th表位的存在不但可增强HCVNP特异性CTL反应性，而且可通过与B表位的内在作用提高抗体水平，从而增加机体抵抗HCV感染的免疫力。
Lechmann等[12]对HCV感染后不同转归的病人进行了体液和细胞免疫研究，共观察了10例抗HCVA血清阳性的无症状献血者(A组)和29例慢性丙型肝炎病人(B组)血清中的抗体水平及对HCV刺激后的淋巴细胞增殖应答，也发现了类似现象:(1)A组病例可出现较强的T细胞增殖应答，但血中肽特异性抗体水平很低甚至检测不出;而B组B细胞应答较普遍;(2)通过在每组用同一肽刺激引起的增殖应答，可确定核心区至少存在5个不同的CTL表位(20~44、39~63、79~103、118~152和148~172位氨基酸)，而E区有3个CTL表位(198~252、308~372、368~392位氨基酸)。作者认为在血清抗-HCV阳性的无症状病人中抗体滴度低的原因可能与这些病人的强T细胞效应抑制了病毒复制从而导致病毒抗原刺激的减弱或消失。
需要注意的是，尽管在感染者体内有特异性CTL，但大部分HCV感染者仍转为慢性。推测其原因可能有:(1)免疫选择压力造成了CTL表位发生突变，导致特异性CTL功能丧失;(2)机体大量淋巴细胞被HCV感染，使机体免疫受损;(3)体内HCV滴度太低，引起机体产生的CTL应答太弱。目前倾向于认为HCV基因高度变异发生免疫逃避，从而使感染持续存在。因此，探讨CTL疫苗的交叉保护性无疑有着重要作用。
Shirai等[13]发现含HIVgp160多重表位的Th表位的合成肽与对MHC选择性低的通用Th表位(promiscuous t epitopes)相似。为研究内源和外源Th表位对CTL效应的影响，作者将合成的NS5区的CTL表位肽(P17)N端与上述HIV的通用Th表位偶联成一嵌合肽(PCLUS3-17)，并比较了其与全长核心区CTL表位肽(C7)、核心区含CTL表位的部分区段(C7A10)在BALB/c小鼠体内诱生抗HCV cTL的差异。结果显示P17肽单独免疫小鼠所诱生的CTL增殖效应明显比PCLUS3-17弱，提示P17肽中缺乏Th表位，而含Th表位的C17能诱生很强的CTL效应;同样，可能缺乏Th表位的C7A10肽诱生的CTL效应亦较弱。作者由此确信，无免疫原性的肽可通过嵌入合适的多Th细胞表位而改造成有免疫原性的肽;对缺乏内源性Th表位诱导活性的CTL表位肽;应共价结合广谱Th表位;对已包含内源性Th表位的CTL表位肽，加入上述广谱Th表位可扩充MHC识别类型，这样可使疫苗的保护作用更有效。这无疑对构建免疫原性强，具有交叉保护作用的CTL合成肽疫苗提供了很好的思路。
已经明确，病毒抗原中同时存在增强性和抑制性表位。为提高免疫保护作用，应努力提高增强性表位的作用，降低和摒除抑制性表位作用。就HCV感染而言，研究CTL增强性表位的报道较多，尚未见抑制性表位或增强性表位抗体对CTL功能影响的研究，也就是注重了病毒抗原表位对CTL功能的正性作用，而忽略了病毒抗原表位及其抗体对CTL功能的负性影响，这样对阐述HCV感染时CTL功能缺陷存在片面性。因此，研究抗HCVA抑制性表位或增强性表位抗体对CTL功能的抑制作用，无疑可以从深层次上揭示HCV感染对CTL功能缺陷的原因，对HCV感染时免疫耐受的形成和指导疫苗的研究均有重要意义。另外，MAP在HIV、FMDV、HBV等保护性抗原分析和分子疫苗中的成功应用，对设计和制备HCV疫苗是一个有益的启示。由Th表位、中和性表位和/或CTL表位组成的并且有一定构象的大分子嵌合肽可能最终成为有效的疫苗。
预防性疫苗
HCV在生物学分类上与动物的瘟病毒和人类的黄病毒相似。已知黄病毒非结构(NS)蛋白和瘟病毒gp33/gp55可刺激机体产生中和抗体，提示与其基因和疏水图非常相似的HCV包膜蛋白可能是机体免疫攻击的靶。Choo等[1]曾用重组痘苗病毒在HeLa细胞中表达的HCV包膜蛋白E1和E2接种7只黑黑猩猩，证实HCV e蛋白诱生的抗体是中和性抗体，可以预防/阻止病毒持续感染，故能够作为预防性疫苗。Farci等[2]将一慢性HCV感染者不同年代的血浆灭活，并与病毒混合后接种黑猩猩，以研究HCV感染者体内是否有特异性中和抗体。结果发现，用该患者感染HCV14年的血浆与病毒混和物接种的黑猩猩全部被感染，而用该患者感染HCV2年的血浆与病毒混和物接种，黑猩猩未发生HCV感染，因此作者认为在慢性HCV感染者体内有HCV准种和特异性中和抗体。随后该作者[3]以HCVH77高变区1(HVR1)合成的两条肽390~410和384~414氨基酸免疫家兔后得到抗HVR1超免疫血清，然后给5只黑猩猩接种这种血清与不同HCV准种H77/H79混合物，结果显示抗-HVR1对同源H77株有免疫防御作用，对混合的HCV准种则无此作用，因此认为:中和抗体攻击的主要靶位是E2/NS1的HVR1，而且抗-HVR1的中和作用有病毒株特异性。
Weiner[4]F发现E2存在两个HVR，并确定HVR含有诱生中和抗体的表位。Rosa等[5]结合细胞荧光标记与流式细胞计数技术，建立了HCVE2蛋白与靶细胞结合中和定量检测系统，结果提示至少存在两个中和性表位，一个是高度变异的，另一个存在于E2的其他区域。Zibert等[6]以成纤维细胞(VH3)研究体外阻断HCV感染也发现抗-HVR1的中和作用有少部分存在交叉反应，不是所有抗-HVR都是株特异的;他们还观察到HCV感染的早期即出现抗包膜糖蛋白上HVR1的抗体可导致自限性感染，说明抗-HVR1具有保护作用，可以阻断HCV感染的发展[7]。所有这些都提示中和抗体的攻击靶位是E2/NS1的HVR1，以HCV包膜糖蛋白HVR1为基础备预防性疫苗是可行的。
但是中和抗体识别的蛋白表位大多是不连续的，即中和性抗原表位大多是构象的，抗体识别的是构型而非组成它们的序列，这在对口蹄病毒(FMDV)中具有诱生中和抗体的肽段的X射线晶体分子衍射分析及其他一些试验得到证实[8];最近的研究也表明E1E2复合体上构型表位的形成对包膜糖蛋白诱导机体产生保护性免疫方面起着重要作用[9]。这就要求在合成HCV包膜糖蛋白的多肽疫苗时不但注意所选择肽段的免疫原性，而且必须考虑免疫原性蛋白和其他蛋白质及核酸三者间的交互作用所涉及到的构象限制。因此，研究并模拟E蛋白表位的构型和在细胞膜上的暴露状态，是最终制备有效疫苗的基础。
多抗原肽(MAP)是以核心基质为交联体或树状臂，将若干条抗原表位相同或不同的单体肽偶联在一起，形成树枝结构，则不但可克服上述方法的不足，而且能很好模拟天然表位构象，具有明显的优越性，已经用于人类免疫缺陷症病毒(HIV)、FMDV、乙型肝炎病毒(HBV)和疟原虫等多种病原体保护性抗原的分析和分子疫苗的设计。MAP骨架仅含多个赖氨酸，能在确切的部位结合4条或8条多肽链，多肽链的分子量可占整个疫苗的95%;由于MAP上肽链结合的数量及位置确切，制备的疫苗结构均一、纯度高，MAP与多肽的结构物免疫原性强，无需再偶联载体蛋白便能诱生高滴度、高亲和力的抗体，而MAP本身没有免疫原性，故既能提高疫苗的质量又能去除载体蛋白的缺陷。
治疗性疫苗
由于目前也有学者认为HCV感染后不能产生有效的保护性抗体，故细胞免疫在抗HCV感染中的作用越来越受到重视。细胞毒性T细胞(CTL)是执行细胞免疫应答的主要效应细胞，属于CD8+T细胞，当其表面受体(TCR)与靶细胞的HCV抗原结合后，在主要组织相容性复合物(MHC)Ⅰ类抗原的介导下，通过溶解受感染的靶细胞达到清除病毒的目的，但同时亦可造成感染组织的损伤。研究表明，丙型肝炎患者的肝脏病理变化主要表现为汇管区淋巴细胞聚集和淋巴滤泡形成，在肝脏碎屑样坏死区以CD4+细胞浸润为主，而在肝小叶区则以CD8+细胞居多;急慢性HCV感染者外周血和肝脏中特异性CTL可以识别HCV编码蛋白质中的一个或多个表位;人工合成的HCV多肽，可在体外刺激CTL增殖，并增强其溶解HCV感染靶细胞的能力，因此CTL在清除HCV感染中可能起重要作用。
Kita等[10]发现用HCV核心区合成多肽反复刺激病人的外周血单个核细胞(PBMC)后，能诱导CD8+的特异性抗HCV cTL，这种CTL不但识别与HLA-B44+分子相结合的核壳蛋白(NP)81-100合成多肽，而且还能溶解VAC-HCV感染的靶细胞。该作者[11]又用重组HCVNP和合成的重叠肽作抗原对3例慢性丙型肝炎病人的PBMC反复刺激，发现他们均可产生能识别NP81-100序列的特异性、HLA-B44+限制中CTL;在1例病人中观察到能识别NP1-120序列的外周血淋巴细胞，并证明其属CD4+T细胞，主要识别NP21-40表位和81-100表位，而NP1-120和Th表位可在体外增强HCV特异性CTL产生。作者注意到此病人血液HCV阴性，丙氨酸转氨酶(ALT)水平也正常，而另两例存在NP却无CTL活性增强的病人，血液HCV阳性，ALT水平升高。作者认为当持续感染HCV时，尽管CTL参与免疫病理损伤导致严重肝损伤，但可加速感染机体中HCV的清除;Th表位的存在不但可增强HCVNP特异性CTL反应性，而且可通过与B表位的内在作用提高抗体水平，从而增加机体抵抗HCV感染的免疫力。
Lechmann等[12]对HCV感染后不同转归的病人进行了体液和细胞免疫研究，共观察了10例抗HCVA血清阳性的无症状献血者(A组)和29例慢性丙型肝炎病人(B组)血清中的抗体水平及对HCV刺激后的淋巴细胞增殖应答，也发现了类似现象:(1)A组病例可出现较强的T细胞增殖应答，但血中肽特异性抗体水平很低甚至检测不出;而B组B细胞应答较普遍;(2)通过在每组用同一肽刺激引起的增殖应答，可确定核心区至少存在5个不同的CTL表位(20~44、39~63、79~103、118~152和148~172位氨基酸)，而E区有3个CTL表位(198~252、308~372、368~392位氨基酸)。作者认为在血清抗-HCV阳性的无症状病人中抗体滴度低的原因可能与这些病人的强T细胞效应抑制了病毒复制从而导致病毒抗原刺激的减弱或消失。
需要注意的是，尽管在感染者体内有特异性CTL，但大部分HCV感染者仍转为慢性。推测其原因可能有:(1)免疫选择压力造成了CTL表位发生突变，导致特异性CTL功能丧失;(2)机体大量淋巴细胞被HCV感染，使机体免疫受损;(3)体内HCV滴度太低，引起机体产生的CTL应答太弱。目前倾向于认为HCV基因高度变异发生免疫逃避，从而使感染持续存在。因此，探讨CTL疫苗的交叉保护性无疑有着重要作用。
Shirai等[13]发现含HIVgp160多重表位的Th表位的合成肽与对MHC选择性低的通用Th表位(promiscuous t epitopes)相似。为研究内源和外源Th表位对CTL效应的影响，作者将合成的NS5区的CTL表位肽(P17)N端与上述HIV的通用Th表位偶联成一嵌合肽(PCLUS3-17)，并比较了其与全长核心区CTL表位肽(C7)、核心区含CTL表位的部分区段(C7A10)在BALB/c小鼠体内诱生抗HCV cTL的差异。结果显示P17肽单独免疫小鼠所诱生的CTL增殖效应明显比PCLUS3-17弱，提示P17肽中缺乏Th表位，而含Th表位的C17能诱生很强的CTL效应;同样，可能缺乏Th表位的C7A10肽诱生的CTL效应亦较弱。作者由此确信，无免疫原性的肽可通过嵌入合适的多Th细胞表位而改造成有免疫原性的肽;对缺乏内源性Th表位诱导活性的CTL表位肽;应共价结合广谱Th表位;对已包含内源性Th表位的CTL表位肽，加入上述广谱Th表位可扩充MHC识别类型，这样可使疫苗的保护作用更有效。这无疑对构建免疫原性强，具有交叉保护作用的CTL合成肽疫苗提供了很好的思路。
已经明确，病毒抗原中同时存在增强性和抑制性表位。为提高免疫保护作用，应努力提高增强性表位的作用，降低和摒除抑制性表位作用。就HCV感染而言，研究CTL增强性表位的报道较多，尚未见抑制性表位或增强性表位抗体对CTL功能影响的研究，也就是注重了病毒抗原表位对CTL功能的正性作用，而忽略了病毒抗原表位及其抗体对CTL功能的负性影响，这样对阐述HCV感染时CTL功能缺陷存在片面性。因此，研究抗HCVA抑制性表位或增强性表位抗体对CTL功能的抑制作用，无疑可以从深层次上揭示HCV感染对CTL功能缺陷的原因，对HCV感染时免疫耐受的形成和指导疫苗的研究均有重要意义。另外，MAP在HIV、FMDV、HBV等保护性抗原分析和分子疫苗中的成功应用，对设计和制备HCV疫苗是一个有益的启示。由Th表位、中和性表位和/或CTL表位组成的并且有一定构象的大分子嵌合肽可能最终成为有效的疫苗。
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